上海中医药大学发现两古方抑制肝硬化作用机制

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日前，上海中医药大学肝病研究所、上海中医药大学中药学院、上海中医药大学科技实验中心科研人员，在国家自然科学基金重大研究计划重点项目、上海市自然科学基金重点项目的资助下，通过实验研究，发现了古方下瘀血汤和一贯煎抑制CCl4大鼠肝硬化形成的不同作用机制。
肝纤维化、肝硬化是一难治性病变，目前西医学仍无有效的对策，而传统中医药却显示出明显的治疗优势。基于中医临床实践对肝炎后肝硬化基本证候病机“血瘀阻络、气阴两虚、湿热内蕴”的共识，针对基本证候病机，科研人员选择了具有代表性的经典方剂：清热利湿茵陈蒿汤、化瘀下瘀血汤、益气黄芪汤、养阴一贯煎（并以小柴胡汤为对照），对4种经典肝硬化大鼠模型(四氯化碳、二甲基亚硝胺、胆管阻塞及猪血清免疫)进行干预治疗的横向比较及二甲基亚硝胺肝硬化不同病理阶段治疗的纵向比较；依据各方剂干预不同病态模型或不同病理阶段的药效学判定结果，进行作用机制的深入研究。探索基于中医证候病机的多种不同功效方剂治疗同一疾病获效的现代科学基础及病证结合研究的新途径。目前，他们在四氯化碳（CCl4）大鼠肝硬化的研究中获得进展，发现基于活血祛瘀的下瘀血汤、养阴的一贯煎可显著抑制CCl4大鼠肝硬化的形成与发展，科研人员进一步从促进增生纤维结缔组织的降解及保护肝细胞、抑制肝细胞凋亡等不同的角度，探讨下瘀血汤、一贯煎抑制成型期大鼠肝硬化的祛邪与扶正的作用机制，为祛瘀与养阴治法干预大鼠肝硬化形成提供了科学证据。
研究人员以CCl43毫升·千克-1皮下注射，再用50%CCl4橄榄油溶液2毫升·千克-1皮下注射，每周两次，第9周开始随机分为模型对照组、下瘀血汤组及一贯煎组，药物干预的同时继续CCl4造模至12周末取材。检测指标包括肝组织病理学，肝组织Hyp含量，肝组织α-SMA、CD68、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2蛋白表达，MMP-2、MMP-9的活性，肝细胞凋亡指数及Cas鄄pase12、HGFα蛋白表达。
与正常大鼠比较，模型大鼠8周时α-SMA、CD68、TIMP-1蛋白表达显著增加（P﹤0.01），12周时显著高于8周模型对照组（P﹤0.01）；MMP-13、HGFα、TIMP-2蛋白表达逐渐降低，各时间点相互比较具有显著性差异（P﹤0.01）；MMP-2，9活性4周时显著升高（P﹤0.01），8周时较4周略有升高，12周时显著高于8周模型对照组（P﹤0.01）；肝细胞凋亡指数、Capase12蛋白表达量逐渐增加，且各时间点比较均具有显著性差异（P﹤0.05或0.01）。与同期模型对照组比较，干预组MMP-9活性及MMP-13、TIMP-2、HGFα蛋白表达量均显著增加（P﹤0.01），其中下瘀血汤组MMP-9、MMP-13显著高于一贯煎组（P﹤0.01），一贯煎组TIMP-2、HGFα显著高于下瘀血汤组（P﹤0.01）；干预组MMP-2活性、TIMP-1蛋白表达显著降低(P﹤0.01)，且一贯煎组显著低于下瘀血汤组（P﹤0.01）；一贯煎组肝细胞凋亡指数、Capase12蛋白表达量显著减少（P﹤0.01）。
研究人员发现，在肝硬化形成期（9~12周）予以下瘀血汤和一贯煎干预治疗后，MMP-13蛋白表达量较同期模型组分别增加了548.25倍、82倍；MMP-9活性/T-IMP-1比值分别增加了1.21倍、0.91倍，下血汤组优于一贯煎组。这种提高基质金属蛋白酶分泌量及其活性的作用可能与刺激枯否细胞（KC）活化有关。而KC可通过表达MMP-13而逆转肝纤维化已得到证实。此次研究显示，CD68蛋白表达8周时开始升高，12周时较8周增加了29.6%，而下瘀血汤和一贯煎干预治疗后较同期模型对照组分别增加了21.8%、22.2%，表明KC在肝硬化的发生、发展和恢复过程中可能发挥着“双刃剑”样作用。而下瘀血汤和一贯煎可能具有“改邪归正”的作用，即通过诱导KC活化并表达MMP-9、13，进而促进间质性胶原的降解可能是两首方剂尤其是下瘀血汤抑制肝硬化形成的重要途径。结合下瘀血汤突出的降低肝组织Hyp含量的作用，表明下瘀血汤的“祛瘀”作用机制可能与提高胶原酶活性进而降解过度沉积的细胞外基质有关。
Caspase-12是内质网凋亡通路的关键酶，各种损伤都会导致内质网应激诱导Caspase-12表达。研究人员指出，从CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏蛋白质组差异表达研究显示，造模12周后模型大鼠有Caspase-12蛋白表达。一贯煎组肝细胞凋亡指数、Caspase-12蛋白表达分别较同期模型组降低了51.0％和50.8％，而下瘀血汤组无显著改善，结合一贯煎可显著提高模型大鼠血清Alb含量的特点，表明抑制肝细胞凋亡可能是一贯煎抑制肝硬化形成的重要机制之一，且这一机制与抑制内质网凋亡通路有关。此外，下瘀血汤和一贯煎干预治疗后，α-SMA蛋白表达量分别下降了21.6%、51.8%，同时MMP-2活性/TIMP-2比值分别降低了22.4％、43.5％，TIMP-1蛋白表达量分别下降了28.3％、39.7％，且一贯煎均显著优于下瘀血汤。提示通过抑制HSCs的活化可能是一贯煎抑制肝硬化形成的又一重要途径。下瘀血汤和一贯煎干预治疗后肝组织HGFα较12周模型对照组分别增加了35.8％、40.0％，提示通过提高肝组织HGFα的蛋白表达，进而促进肝细胞的有丝分裂、激发肝脏胶原酶的活性和促进活化的肝星状细胞凋亡，可能是一贯煎和下瘀血汤抑制肝硬化形成的共同作用途径之一。
负责此项研究的上海中医药大学副校长刘平指出，中医方剂是在中医理论指导下针对证候病机的中药组合配伍形式，是一复杂系统，也是研究中医理论复杂体系的主要载体。立足于中医临床实践对肝炎后肝硬化基本证候病机的共识，针对证候病机，进行不同功效古典方剂的比较对照研究，不仅能够部分揭示下瘀血汤和一贯煎抑制肝硬化形成的不同作用机制，显示出中医药“同病异治”理论的科学内涵；同时也为“祛邪与扶正”治法理论获得部分生物学作用基础的诠释。刘平总结认为，下瘀血汤的祛瘀作用主要表现为提高肝组织胶原降解活性，促进异常沉积的纤维结缔组织的降解；而一贯煎的“养阴扶正”作用主要在于抑制肝细胞凋亡和HSC的活化，保护患病机体的“正气”。