中药新药长毒动物血液生化测定SOP建立研究

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中药新药研究过程中，药品安全性评价是新药研究开发的重要前提。而长期毒性试验（以下简称长毒）又是安全性评价中的重中之重。长毒血液生化的检测结果常常是评判肝肾等重要脏器功能是否正常的客观而又灵敏的指标。但是，血液生化检测结果却受到诸多因素的影响。由于长期以来长毒动物血液生化检测缺乏一大家认可的规范化（标准化）操作规程（SOP），各实验室在血液生化检测的取材、标本保存直至最后的测定上均有各自一套方法和习惯，加之实验动物在种属、饲养条件上的差异，致使各实验室长毒血液生化指标差异甚大。
我国实验动物血液生化值迄今尚无参考价值很强的正常值与正常范围，严重影响了药物安全性评价的客观性与准确性。基于此，我们课题组在国家科技部科技基础性工作和社会公益研究专项“长毒试验动物血液生化测定规范化研究”项目的支持下，使用SPF级大鼠及健康Beagle犬，应用全自动生化测定仪对影响血液生化测定的各项条件进行系统的考查，并在最终制定的SOP条件下，建立不同种属、年龄、性别SPF级大鼠（SD、Wistar大鼠）及Beagle犬血液生化指标的正常值与正常范围。从而为中药新药的安全性评价提供一个参考价值很强的数据评判体系。具体研究内容如下：
影响因素的考查
1．采血方法对血液生化值的影响
大鼠长毒试验中，采血部位多种多样，如股动脉采血、股静脉采血、颈外静脉采血、眶后静脉丛采血、摘眼球采血、断头及剪尾采血（后三种属动静脉混合血）等方法。这些部位采血其血液生化值是否存在差异，无人进行过系统研究，课题对动-静脉血、前腔静脉与后腔静脉血及眶后静脉与股静脉血液生化值的比较，结果表明不同部位采血，其部分血液生化值存在明显差异，动静脉血清及颈外静脉与后腔静脉血液生化值主要在总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）上存在明显区别，表现为股动脉或颈外静脉血清中总蛋白、白蛋白明显高于后腔静脉血；大鼠眶静脉与股静脉血液生化值在多项指标上存在明显区别。这可能与采血时眼内液的混入有关。
2．样品制备方法对血液生化值的影响
采用全自动生化仪对不同制备方法血液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素 （Urea）、肌酐（Cre）、葡萄糖（Glu）、总胆固醇（CHO）、总胆红素（TBil）等生化值进行测定，以探讨血液不同制备方法对其血液生化值的影响。结果表明，血液样品制备过程中，抗凝与否，离心条件（温度、速度）以及动物禁食时间长短，除常规离心速度（相对离心力1000～4000g）对血液生化值未见明显影响外，其余各项条件均不同程度影响测定值。
3．血样存放时间对生化值的影响
采用全自动生化仪对存放不同时间动物血液中ALT、AST、TP、ALB、TBIL、ALP、UREA、CRE、GLU、CHO等生化值进行测定，探讨不同存放时间对所测定血液样本生化值的影响。结果表明，相同温度存放不同时间对部分血液生化值存在明显影响，在温度一定的条件下，存放时间愈长，血液生化值变化愈多或愈大。其中，存放时间对TP、ALB及CHO影响最明显，而TBIL、ALT、AST在低温条件下较存放4℃条件为稳定，尤其保存时间在5天以上者。但试验也显示，无论是-18℃、-30℃还是-80℃存放，部分生化指标均与放置前有明显区别。相对而言，不经冻融，4℃保存相对较短时间（如48小时内）更能反映血液生化的“真值”。不同温度放置大鼠血清2天，4℃条件存放明显优于低温冻存，表明短期存放（2天内）不宜冷冻只宜冷藏。
4．存放温度对生化值的影响
采用全自动生化仪对存放不同温度动物血液中ALT、AST、TP、ALB、TBIL、ALP、UREA、CRE、GLU、CHO等生化值进行测定，探讨不同存放温度对所测定血液样本生化值的影响。结果表明，不同温度存放相同时间，血清生化值出现不同程度的变化。其中，存放时间对TP、ALB 、ALT、CHO及TBIL影响最为明显。
标准操作规程（SOP）制定
动物采血前12小时禁食（不禁水）。大鼠乙醚浅麻醉后于颈外静脉、Beagle犬从前肢皮下头副静脉采血。每批次试验，采血时间应控制在2～3小时内。采血后室温（20～22℃）放置4～5小时（已有足量血清析出）后离心分离血清。血样4℃条件常规离心。分离的血清不宜冷冻保存，可临时4℃冷藏待测。Beagle犬血清宜当日测定。大鼠血清4℃冷藏时间不宜超过2天。
应采用可靠性高的测定仪器（全自动生化测定仪及电解质测定仪）进行血液生化测定，测定前应采用定值质控血清对仪器进行检查，必要时应先采用标准（校正血清）先定标，然后进行测定。
长毒试验动物血液生化正常值及正常范围的确定
在所确定的SOP条件下，分别对不同性别、不同年龄SPF级环境条件下SD大鼠、Wistar大鼠及健康Beagle犬（I级）血液生化指标ALT、AST、ALP、TP、ALB、Urea、Cre、Glu、CHO、Tbil、甘油三酯（TG）、γ-谷氨酰基转移酶（γ-GT）、肌酸激酶（CK）和钾（K）、钠（Na）、氯（Cl）等共计16项进行了测定。并根据严格的统计学分析与计算，求出长毒试验动物正常参考值范围。该参考值将为中药新药安全性评价提供一个参考价值很强的数据评判体系。