人凝血酶原复合物分离纯化技术推陈出新

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近年来，随着我国肝炎发病率的增加，以及临床医师对人凝血酶原复合物（PCC）制剂治疗效果的认同，PCC制剂被大量应用于临床肝脏出血的患者，需求量逐年增加。PCC包括凝血因子II（凝血酶原）、VII（稳定因子）、IX（抗乙型血友病因子）、X（自身凝血酶III）。现有的PCC分离纯化方法主要为直接从血浆中用凝胶吸附和低温乙醇沉析并经凝胶吸附，其中直接从血浆中用凝胶吸附的方法又分为经典的批式吸附法和半流动吸附法。由于血浆中抑制凝血因子活化的一些天然抑制剂会被乙醇所灭活，从而使凝血因子活化，所以目前大多数血液制品生产企业采用直接从血浆或去冷沉淀的血浆中用凝胶吸附的方法制备PCC。但是，PCC制剂中含有部分杂蛋白，尤其是被激活的因子Xa、IXa、VIIa等，临床输注偶可诱发弥散性血管内凝血（DIC）和血栓并发症。为避免这一问题，需要进一步改进分离纯化工艺。可喜的是，近年来，随着现代生物分离纯化技术的发展，出现了一些新型单元分离技术，如亲和层析法、逆胶束法、扩张床吸附技术（EBA）、双水相分配技术等，其中最为成功的扩张床吸附技术已被应用于工业规模的生产。
▲批式吸附法：操作麻烦且成本较高
经典的批式吸附法经荷兰红十字会输血中心Heysteck等人提出，后经Brumm-elhuis等人完善后被用于大规模制备PCC。具体工艺为：血浆（去冷沉淀上清）加DEAE-SephadexA50(1~1.5克干重/升血浆)，在10℃~15℃下搅拌45分钟；去离心分离出的上清，进一步分离其他血浆蛋白，分离出的凝胶用pH值7.0、含0.01摩尔/升枸橼酸钠的0.2摩尔/升的氯化钠溶液洗涤3次，将洗液废弃（此过程会造成凝血因子II约20％的损失）；再用pH值7.0、含0.015摩尔/升枸橼酸钠的2.0摩尔/升的氯化钠溶液洗脱两次；洗脱液经SephadexG-25凝胶过滤脱盐后，加入0.3%磷酸三丁酯和1%吐温80经24℃～26℃、6小时病毒灭活；最后经除菌过滤后，分装、冻干得成品。通常在PCC制备的最后阶段前，要加入肝素或肝素与抗凝血酶III，以防止或减少凝血因子活化。但是，该工艺存在明显的缺点：吸附是在搅拌罐内进行，由于凝胶的机械强度不高，所以凝胶的破损率大，生产成本高；PCC经批式吸附后，洗涤和洗脱需在柱内进行，操作麻烦，易产生交叉污染，血浆处理量受到限制。
▲半流动法：控制简单、吸附能力较强
为克服经典批式吸附法的缺点，美国红十字会Holland实验室的Tharakan等开发了一种半流动方法，即用离子交换吸附剂从去冷沉淀血浆中制备PCC。该方法采用一个带搅拌功能的圆柱，而无需手工操作，可增加血浆与凝胶的接触，减少总的操作时间。
具体工艺为：将DEAE-SephadexA50用0.85摩尔/升的氯化钠溶液溶胀，淘洗出细小颗粒，加入与凝胶等体积量的0.075摩尔/升的氯化钠溶液，121℃灭菌30分钟；将准备好的850克凝胶灌进圆柱，经0.8微米的筒式滤器泵入去冷沉淀的血浆50升；搅拌25分钟，以2升/分钟的速度放出血浆；用0.07摩尔/升枸橼酸钠的（pH值为6.0）溶液悬浮洗涤60分钟，洗两次；然后用0.2摩尔/升枸橼酸钠（pH值6.0）溶液洗脱PCC；其余过程同经典批式吸附法。
与批式吸附法不同的是，半流动法中血浆与离子交换剂在圆柱体内连续流动混合，未吸附血浆的去除过程包含在吸附过程中，洗涤、洗脱在同一容器内，因此过程控制简单，并较经典方法可显著地改进凝胶吸附凝血因子II和凝血因子IX的能力。研究表明，批式吸附法和半流动法中凝血因子II、凝血因子IX、凝血因子X的活性回收率分别为27.6%和60%，49.1%和68%，51.2%和57.1%，所以半流动法优于批式吸附法。
▲亲和层析法：用于制备高纯制剂工艺成熟
亲和层析法是生产高纯凝血因子IX的成熟工艺，法国CRTS公司就采用亲和层析法生产凝血因子IX高纯制剂。该方法主要是采用肝素－琼脂糖CL-6B凝胶亲和层析，所得凝血因子IX的平均比活达119±10国际单位/毫克，平均得率为320±28国际单位/升血浆。另外，目前也有公司采用鼠源抗-凝血因子IX单克隆抗体纯化凝血因子IX，其比活可达204~273国际单位/毫克；也可通过金属鳌合亲和层析纯化凝血因子IX，通常是将含凝血因子IX的高盐溶液加入铜离子鳌合琼脂凝胶层析柱，用低pH值和低盐的缓冲液洗脱凝血因子X，随后用含氨基乙酸的缓冲液将凝血因子IX洗脱出来，所得产品的比活达160国际单位/毫克；若增加亲和步骤，如将拟亲和层析－亲和层析－鳌合层析－羟基磷灰石层析组合，所得产品的比活可达240~300国际单位/毫克。
▲扩张床吸附技术：变“竭泽而鱼”为“金钩钓鱼”
扩张床吸附（EBA）技术作为一项新型分离技术，一改早期的分离过程设计中往往围绕杂质的去除来进行分离纯化的思路，而采用从组分复杂的料液中直接获得目标产物的设计思路。相关研究人员将这种观念上的改变形象地比喻为由“竭泽而鱼”到“金钩钓鱼”。这种观念上的转变符合现代分离技术的发展趋势。
中科院过程工程研究所的路秀玲等开展了用扩张床吸附高效纯化牛血红蛋白的研究。他们采用STREAMLINESP吸附剂直接从牛血红细胞破碎液中纯化血红蛋白。所确定的优化吸附条件为：吸附过程选用离子强度为10毫摩尔/升的磷酸盐缓冲系统，进料线速度为198厘米/小时，进料pH值6.6，改变缓冲液pH值为7.2进行洗脱，操作温度4℃。实验结果表明，在该条件下，动态吸附容量达70~75毫克/毫升，只经一步操作产品纯度即达电泳纯。丹麦的Upfront Chromatography A/S公司也利用EBA技术直接从人血浆中分离纯化出白蛋白、丙种球蛋白、α1－抗胰蛋白酶、纤维蛋白原和凝血因子。EBA技术适合处理组分复杂、料液黏度大、洗涤困难的物料。
▲我国现状：质量标准低于欧洲工艺水平有待提高
关于PCC的质量标准，《中国药典》2005年版规定，PCC中凝血因子IX的效价不低于10国际单位/毫升，且凝血因子IX的比活性不低于0.3国际单位/毫克蛋白质。对比《欧洲药典》2005版的规定，即PCC中凝血因子IX的效价不低于20国际单位/毫升，且凝血因子IX的比活性不低于0.6国际单位/毫克蛋白质，由此可见，我国的PCC质量标准低于《欧洲药典》，这也反映出我国的PCC分离纯化工艺有待提高。
目前，国外的研究重点是耦合多种层析分离技术，制备各种含单一凝血因子，如凝血因子IX、VII、XI等的浓缩制剂。我国的血浆蛋白分离纯化主要是低温乙醇沉淀分离纯化技术，层析分离纯化技术仅在部分小制品的分离中采用。目前，仅有部分厂家采用经典吸附法生产，存在处理量小，产量低，因子活性损失大等缺陷。因此，我国PCC分离纯化工艺与国外还有较大差距。